手术指导：在大鼠脑内放置光遗传学植入子

在大鼠脑内放置一个光遗传学植入子

植入用于光遗传学刺激和生物电记录（EEG、ECG 和 EMG）的植入子的指导。

手术由Conor Underwood博士在奥塔哥大学进行。ADInstruments 支持主管 Mark de Reus 详述了手术过程。

步骤: 

植入子消毒 [00:01:07]

在这步中，您将为手术准备植入子。

缩短光纤 [00:01:07]

 

• 做一个环来缩短光纤的长度而不要切割它。确保环靠近植入子主体，因为它将位于动物体内。环的大小取决于所需的光纤长度。
• 将光纤线和生物电导线的末端放在一截 PE 管内。用一组弯夹固定。
• 用 2-3 根缝线固定植入子的光纤环。

消毒植入子 [00:03:00]

TR58AB 光遗传学生物电植入子 在其包装内是无菌的。手术前如果在有菌环境中处理过设备，请消毒设备。

• 拿起设备的主体部分，将植入子转移到瓶子或容器中。用强力消毒剂（如 Cidex OPA）充满瓶子和盖子，然后浸泡设备 20 分钟。
• 用无菌无热原水或生理盐水冲洗瓶子和植入子 3 次。

手术设置和动物准备[00:04:25]

这一步，您将准备好术区进行清洁手术。您还将麻醉和消毒动物进行手术并连接监测设备。

• 用洗必泰喷雾清洁术区和仪器托盘，包括显微镜、灯和立体定向头架。
• 在术区铺一块抹布，方便大鼠剃毛后除毛。

麻醉和消毒动物 [00:06:21]

 

• 将大鼠放进诱导箱内，用 5% 异氟醚麻醉。
• 将麻醉好的动物拿到术区，并将大鼠的鼻子放在异氟醚管内。降低浓度至 2.5%-3%。定期捏脚趾确保大鼠保持麻醉。注意：只要动物能保持昏迷状态，就使用最低浓度的异氟醚。
• 润滑并插入直肠探头。将探头贴在大鼠的尾巴上可以防止它在术中移动。
• 将脉搏血氧仪连接到足部并用胶带固定。
• 皮下注射抗生素和消炎药。注意：该手术注射了利福平和卡洛芬。

 

• 剃掉大鼠的腹部、头部以及腹部和头部之间放植入子导线的通路上的毛。从术区取走抹布和剃下的毛。注意：使用胶带或粘毛滚筒去除多余的毛。
• 在大鼠的眼睛上涂抹眼部润滑剂。
• 用必妥碘或碘清洁手术部位 - 腹部、头部和连接区域。
• 用 100% 乙醇清洁手术部位。

打开手术设备包装 [00:12:43]

• 用洗必泰喷雾清洁术区和仪器托盘，包括显微镜、灯和立体定向头架。
• 在术区铺一块抹布，方便大鼠剃毛后除毛。

操作开始：插入植入子 [00:14:12]

这一步，您将在大鼠腹部切开一个切口并插入植入子。

皮肤切口 [00:14:12]

 

• 使用手术刀在腹部切开一个切口。这个切口要足够大，能将植入子主体装进大鼠腹部。植入子主体的尺寸为 31.5 x 24 x 11 毫米。 注意：如有必要，可以用剪刀延长切口。
• 用 Metzenbaum 剪刀钝性分离皮下组织。
• 用夹子保持伤口开放。

肌壁切口 [00:14:12]

 

• 找到白线，即腹部中线的一条白色结缔组织垂直线。这条线是您应该做切口的地方。
• 用镊子抓住并提起肌肉壁，防止损伤腹腔器官。在腹肌壁结缔组织中线做一切口。
• 用一把剪刀扩大小切口。继续切到切口足够大能放进植入子主体。

插入植入子 [00:17:52]

• 如果您已消毒了植入子，请用无菌镊子将植入子从瓶中取出。小心提出导线，然后取出植入子主体。将其放在无菌手术区。

 

• 取下保护导线尖端的 PE 管和夹子。
• 将植入子插入切口，植入子主体的导线端先进。注意：您可以在插入后重新调整植入子位置。
• 使用齿镊，抓住植入子主体上的缝合板并重新调整植入子位置。注意：应该放在右下腹，防止阻塞结肠。
• 将丝线穿过缝合板上方的肌肉壁。
• 将丝线穿过植入子主体上的缝合板。
• 将丝线穿过第一个穿孔附近的肌肉壁并打结。

 

• 剪去多余的缝线。
• 对缝合板第二个孔重复此步骤。
• 在关闭肌肉壁之前，检查固定光纤环的缝线是否固定良好。检查腹部是否有足够的光纤长度，能放置合适。这个环将位于皮下间隙。
• 用单丝可吸收缝线缝合伤口。

 

用套管通导线 [00:26:50]

在这一步，您将穿出一条皮下通道。导线将穿过这条通道，从腹部到后脑勺。

• 用 Metzenbaum 剪刀钝性分离尽可能远的皮下组织。
• 使用斜面套管在肌肉和皮肤之间穿出一条通道。

 

• 在皮下推动和扭转套管尖端使其向前。必要时旋转大鼠并提起手术单。
• 一旦套管尖端抵达大鼠头后部，将无菌纱布放在大鼠头部下方。
• 确定套管尖端在皮下的位置。在头后部的皮肤上做一个小切口。
• 将套管推出切口。注意：此过程中处理动物的手不再是无菌的，不应用于接触清洁区域。

 

• 使用无菌手套将光纤和生物电导线推入套管。不要从套管的另一端取下导线的尖端，以免它们接触到未消毒的表面。
• 将纱布放在腹部伤口上，将手术单向下折叠并查看大鼠的头部。

移到立体定向头架 [00:29:54]

这一步，您将把动物固定在立体定向头架中准备进行颅脑手术。

 

• 向立体定向头架供应麻醉气体。
• 提起大鼠，旋转它，使动物的腹部朝下。将大鼠的鼻子放进麻醉部件。确保手术单保持折叠在身体下方以保护腹部伤口。
• 使用无菌塑料膜作为手术单，铺在动物的头上进行颅脑手术。
• 确认导线在套管尖端内，然后从皮下间隙慢慢取出套管。
• 将 PE 管重新连接到植入子导线尖端以防止损坏。确保导线位于手术单上方，方便一会用。
• 将加热垫移到动物下方。

颅脑手术/准备颅骨 [00:33:04]

这一步，您将做一个颅骨切口并确保颅骨位置水平以便钻孔。

 

• 剪开塑料单，露出大鼠的头。
• 使用手术刀和剪刀在颅骨后部的皮肤上做一个切口。用剪刀去除多余的结缔组织。
• 用夹子将皮瓣向后固定，改善颅骨暴露。
• 使用棉签将结缔组织从颅骨顶部剥离。
• 电灼任何出血的毛细血管。
• 使用显微镜，从颅骨表面刮掉任何多余的结缔组织。注意：特别是清除人字点（lambda）和前囟（bregma ）颅骨标志周围的任何组织。

• 确保颅骨表面水平。使用立体定向头架上的微定位器测量 z 轴上人字点和前囟的深度。将针尖放在每个标志上并读取微定位器的 z 轴。
• 根据需要重新定位大鼠，使人字点和前囟之间的差异不超过 0.2 毫米。

钻孔和插螺钉 [00:40:24]

这一步中，您将给光纤在颅骨钻一个孔。您还将插入螺钉用于固定生物电导线和牙科水泥。

 

• 使用立体定向定位和电灼装置在颅骨上标记要钻孔的点。该位置相对于人字点或前囟标志，将取决于需要注射视蛋白的区域。
• 使用 dremel 钻和一个合适的消毒钻头小心地钻入颅骨。

• 用精细镊子剥去最后一层薄薄的骨板。
• 用梭形海绵吸去任何液体。

 

• 使用不同的钻头放生物电导线的螺钉。钻头的大小将取决于螺钉的直径。
• 在颅骨钻出螺钉孔。这些孔的直径较小，无法清除骨碎片。 孔要钻干净，这个很重要，否则螺钉可能不合适。如果硬脑膜被刺破，您可能会看到一点出血。用棉签清洁。
• 使用镊子和螺丝刀拧紧第一个螺钉。如有必要，用稍大的钻头手动扩大孔。两个螺钉要连生物电导线到颅骨，而另外 5-6 个螺钉将固定牙科水泥。
• 对后续螺钉重复此步骤。

病毒注射 [00:48:15]

这一步中，您将把病毒载体注入大脑的正确部位以进行视蛋白表达。

 

• 用 26 号针划开硬脑膜。 

• 小心不要切开一些血管。如果血管受损，请使用一片明胶海绵，它可以起到止血的作用。
• 将注射泵或输液泵连接到立体定向头架。
• 将针头移到颅骨标志之一，例如前囟。计算大脑中视蛋白输送的坐标。
• 注射病毒。通常，每个注射部位需要 250 纳升的病毒载体，但这取决于载体。注意：由于输液速度低，注射过程可能需要半小时。

连接生物电导线 [00:52:23]

在这一步中，您将把生物电导线连接到颅骨螺钉上。在本例中，正极导线连接到运动皮层上方的螺钉，负极导线连接到小脑上方。

• 清除任何残留的血液。
• 从 PE 管中取出生物电导线。

 

• 将正极线（红色）尽可能多次地缠绕在螺钉上。保持导线的硅套在螺钉和组织之间，防止导线通过组织短路。
• 对负极线（黑色）重复此操作。
• 确保导线周围的颅骨干燥。这对于牙科水泥的粘附很重要。

定位光纤探头 [00:55:59]

在这一步中，您将把光纤垂直放置在颅骨上方所需的位置。

 

• 使用一个插入工具将光纤垂直置于伤口上方。这个工具是一个带槽的夹子，它的一侧打开，一旦光纤就位，就可以很容易地取下夹子。注意：此插入工具是定制的。使用任何能确保完美垂直方向的设备。
• 从 PE 管中取出光纤并将其连接到插入工具。如果需要的光纤更长，请缓慢轻柔地从通道拉动光纤。注意：请勿将光纤弯曲小于 5mm。
• 计算探头相对于前囟标志的正确坐标。确保螺钉周围区域干燥。

插入光纤探头并用牙科水泥固定[00:58:31]

在这一步，您将插入光纤并用牙科水泥固定。

• 按照制造商的规定混合牙科水泥。
• 将光纤探头向下移动到大脑中。深度将取决于表达视蛋白的大脑区域的坐标。

 

• 一旦探头就位，使用注射器和针头喷一层牙科水泥。第一层应该相对较薄。牙科水泥不会粘附在肌肉或组织上。造型要快，因为水泥会在 1-2 分钟内变干。

• 在前几层上堆积水泥，尤其是在探头周围，将其固定到位。
• 干燥几分钟后，用针头检查水泥是否凝固。

 

• 牙科水泥硬化后，将插入工具从探头上拆下。
• 使用液体稠度的牙科水泥填充任何裂缝。使用较厚的稠度在探头周围堆积。
• 等水泥堆充分干燥。

 

• 用缝线打一个环。将环套在光纤和水泥堆上。
• 将缝线的一端粘到立体定向头架上，好将光纤拉向水泥堆。注意：请勿将光纤弯曲小于 5mm。
• 用牙科水泥覆盖光纤。用较稠的水泥，使其不会积聚在伤口中。
• 用手指塑形水泥。为防止水泥粘在手套上，请先将它们浸入乙醇中。
• 修整水泥堆周围的任何锋利边缘。
• 在水泥堆后面用几条缝线缝合水泥堆周围的伤口。
• 割断用于固定住光纤堆水泥的缝线环。

 

• 在水泥堆前缝另一根线。
• 取下塑料手术单。

缝合腹部伤口[01:15:37]

在这一步中，您将缝合用于插入植入子的腹部伤口。

• 从立体定向头架中取出动物。旋转动物，然后将其背面放在手术区域。

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我们希望您发现这些手术指导有用。

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如果您有任何问题，请 联系您的 ADInstruments 支持代表，他们将很乐意为您的研究需求提供具体信息和帮助。

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